醫(yī)療器械產品注冊
技術審評報告
（境內)
產品中文名稱：miR-92a 檢測試劑盒（熒光RT-PCR 法）
產品管理類別：三類
申請人名稱：深圳市晉百慧生物有限公司
國家食品藥品監(jiān)督管理總局
醫(yī)療器械技術審評中心
基本信息
一、申請人名稱
深圳市晉百慧生物有限公司
二、申請人住所
深圳市南山區(qū)桃源街道田寮工業(yè)A 區(qū)9 棟二樓西面
三、生產地址
深圳市南山區(qū)桃源街道田寮工業(yè)A 區(qū)9 棟二樓西面
深圳市南山區(qū)桃源街道田寮工業(yè)A 區(qū)田寮大廈1503
產品審評摘要
一、產品概述
（一）產品主要組成成分
該產品配套使用的核酸提取試劑為深圳市晉百慧生物有限公司生產的核酸提取試劑， 備案號為： 粵深械備20150228 號。
（二）產品預期用途
該產品用于體外定性檢測人糞便樣本中的miR-92a 核酸。
該產品用于便潛血陽性、綜合其他癥狀如排便習慣改變、大便形狀變化、慢性便秘、排便里急后重等經臨床醫(yī)生診斷建議腸鏡檢查同時由于不同原因拒絕進行腸鏡檢查的患者，用于臨床對大腸癌的輔助診斷。檢測結果陽性不作為大腸癌早期診斷或確診的證據(jù)，檢測結果陰性也不能排除大組成成分管數(shù)裝液量腸癌的可能，患者最終診斷應依據(jù)腸鏡檢查結果。該產品不用于普通人群的腫瘤篩查。
大腸癌按《惡性腫瘤TNM 分類法》分為0 期，I 期，II期，III 期，IV 期，早期一般呈現(xiàn)如排便習慣改變、大便形狀變化、大便帶血、慢性便秘、排便里急后重等癥狀，但常因癥狀輕微和不典型而被忽視。miR-92a 來自人類13 號染色體上的miR-17-92 基因簇，是一類小分子非編碼RNA。miR-92a 通過靶向抑制PTEN、KLF4 和下游的p21 基因，可促進大腸癌細胞的增殖和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌患者糞便樣本中miR-92a 含量特征性增高。
（三）產品包裝規(guī)格
48 人份/盒
（四）產品檢驗原理
miR-92a 檢測試劑盒（熒光RT-PCR 法）是采用RNA 提取試劑盒提取糞便中的RNA，進行RT-PCR 反應，反應中的引物、探針能夠與miR-92a 反轉錄產物特異性結合并進行PCR 擴增，在擴增過程中探針與含miR-92a 模板的反轉錄cDNA 鏈互補結合后，探針5’端熒光染料基團被Taq 酶切下并釋放熒光信號，被檢測到的熒光信號強弱可以反映樣本中miR-92a 的含量。
二、臨床前研究摘要
（一）主要原材料
1.主要原材料的種類
該試劑盒主要原材料包括：Taq 酶、反轉錄酶、miR-92a反轉錄引物、miR-92a 上游引物、miR-92a 下游引物、miR-92a探針、miR-92a 基因RNA 片段、dNTP、RNA 酶抑制劑。
2．主要原材料的選擇
2.1 外購的主要原材料包括：Taq 酶、反轉錄酶、dNTP、RNA 酶抑制劑。通過使用各成分配制反應體系，以大腸癌陽性糞便樣本進行功能性試驗，篩選最佳供應商。
2.2 自行設計的主要原材料包括：miR-92a 反轉錄引物、miR-92a 上游引物、miR-92a 下游引物、miR-92a 探針、miR-92a基因RNA 片段。通過功能性試驗進行確認。
申請人設計了完整的企業(yè)參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、精密度參考品、線性范圍參考品、干擾物質參考品。陰性參考品包括腸癌陰性糞便樣本、食道癌患者糞便樣本、胃癌患者糞便樣本；陽性參考品、精密度參考品、干擾物質參考品采用大腸癌糞便樣本；檢測限參考品、線性范圍參考品采用合成的miR-92a 基因RNA 片段稀釋配制而成， 檢測限參考品濃度為1×104copies/μL 的miR-92a 基因RNA 片段， 線性范圍參考品濃度為1×107copies/μL 的miR-92a 基因RNA 片段。各項企業(yè)參考品綜合用于產品檢測靈敏度、特異性和重復性評價。試劑盒內質控品包括質控品1 和質控品2，質控品1 含有miR-92a 基因RNA 片段，質控品2 為0.1%DEPC 水，用于檢測過程中的質量控制
（二）生產工藝及反應體系研究
1. 反轉錄
申請人對PCR 反應體系中各主要原料（反轉錄酶、反轉錄引物、RNA 酶抑制劑、dNTP、MgCl2、PCR 反應緩沖液）的濃度及用量，以及反轉錄程序進行優(yōu)化試驗，確定了最佳的反轉錄試劑的生產工藝及反應體系。
2.熒光PCR 擴增
申請人對PCR 反應體系中各主要原料（Taq 酶、MgCl2、dNTP、引物、探針、PCR 反應緩沖液、50% 甘油）的濃度及用量以及PCR 反應程序進行優(yōu)化試驗，確定了最佳的熒光PCR 擴增試劑的生產工藝及反應體系。
3.申請人也對RNA 濃度、反轉錄模板量、PCR 模板量、糞便樣本量、樣本采集方法進行了研究，進一步確定了試劑盒反應體系的各項參數(shù)和指標。
（三）分析性能評估
該產品分析性能包括檢測限、陰性符合率、陽性符合率、精密度、干擾物質、線性范圍等。
最低檢測限評估中，申請人采用高濃度miR-92a 陽性參考品梯度稀釋于提取的不含miR-92a 基因的糞便樣本中，分別進行25 次重復檢測，得到檢出率為95%的濃度水平為100copies/μL 作為本試劑的最低檢測限。陽性符合率評估中，申請人采用臨床確診為大腸癌早期患者、大腸癌中期患者、大腸癌晚期患者糞便樣本各5 份來進行檢測，檢測結果顯示陽性符合率達到100%。在精密度研究中，申請人采用晚期和中期大腸癌患者糞便樣本，評價了本產品批內及批間精密度，結果顯示三批試劑的批內和批間檢測Ct 值CV%均不高于5%。
陰性符合率評價中，申請人針對miR-92a 基因與其他同源基因和miR-92a 陰性樣本非特異反應進行評價，樣本包括食道癌患者糞便樣本、胃癌患者糞便樣本、息肉患者糞便樣本、腺瘤患者糞便樣本、胃炎患者糞便樣本、腸炎患者糞便樣本、闌尾炎患者糞便樣本、結腸炎患者糞便樣本、消化性潰瘍患者糞便樣本、肝癌患者糞便樣本、胰腺癌患者糞便樣本、膽管癌患者糞便樣本、口腔癌患者糞便樣本及大腸癌陰性樣本。經驗證食道癌樣本、胃癌樣本、息肉樣本、腺瘤樣本、胃炎樣本、腸炎樣本、闌尾炎樣本、結腸炎樣本、消化性潰瘍樣本、肝癌樣本、胰腺癌樣本、膽管癌樣本、口腔癌樣本與該產品未見交叉反應，與miR-92a 陰性樣本未產生非特異反應，與常見的miR-135b 和miR-21 基因不產生交叉反應，與人體細胞組織中的GAPDH 基因、β-actin 基因以及U6基因等DNA 不產生交叉反應。
干擾試驗結果顯示大腸癌糞便水狀樣本不能用于檢測；帶血糞便樣本中，樣本中血紅蛋白含量超過＞8.0mg/mL 后，不能用于檢測；糞便樣本中膽紅素含量≤0.2mg/g 時，血清白蛋白含量≤10mg/g 時，對檢測結果不會產生影響；糞便樣本中白細胞含量≤4×106 個/mL 對檢測結果不會產生影響；糞便樣本中維生素C 含量≤14μg/g、尼莫司汀含量≤50 μg/g、鹽酸吉西他濱含量≤5mg/g、苯丁酸氮芥含量≤120μg/g 時，對檢測結果不會產生影響。
線性范圍評估中，申請人采用高濃度miR-92a 陽性參考品梯度稀釋于提取的不含miR-92a 基因的糞便樣本中，分別重復檢測3 次，得出線性相關系數(shù)r2≥0.980 的線性范圍為102copies/μL-106 copies/μL。針對核酸提取純化步驟，申請人對其生產的核酸提取試
劑進行研究，結果顯示該試劑盒核酸提取效率大于90%，提取樣本用于試劑盒檢測性能良好。通過以上評價，選擇晉百慧公司生產的核酸提取試劑（備案號為：粵深械備20150228號）作為該產品核酸提取純化方法。
本次申報產品包裝規(guī)格為48 份/盒，申請人提供了六批產品（批號為：20131201、20131202、20131203、20161001、20161002、20161003）在所有適用機型上的性能評估資料。
（四）陽性判斷值
通過深圳人民醫(yī)院提供的健康人的糞便樣本150 例、大腸癌患者樣本120 例，同時從香港中文大學獲得49 例正常人糞便樣本、76 例大腸癌患者糞便樣本、36 例息肉患者糞便樣本、30 例肝癌患者糞便樣本、30 例腸炎患者糞便樣本、30 例食道癌患者糞便樣本、30 例胃癌患者糞便樣本、30 例腺瘤患者糞便樣本、30 例胃炎患者糞便樣本、30 例闌尾炎患者糞便樣本、30 例結腸炎患者糞便樣本、30 例消化性潰瘍患者糞便樣本、30 例胰腺癌患者糞便樣本、30 例膽管癌患者糞便樣本、30 例口腔癌患者糞便樣本，采用miR-92a 檢測試劑盒（熒光RT-PCR 法）對其進行檢測，檢測結果采用SPSS15.0 統(tǒng)計分析軟件進行ROC 曲線分析，根據(jù)約登指數(shù)的分析結果，取約登指數(shù)最大所對應的Ct 值為陽性判斷值（Cut-off）為30.75。試劑盒有效性判定：
1.質控品1：Ct 值在30.70-32.3 范圍內且有明顯指數(shù)增長期；
2.質控品2：Ct 值＞36.00 或無Ct 值，線形為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期；
以上結果符合要求，檢測結果才有意義；否則，應重復檢測。
結果判定：
1.樣本的Ct 值＞30.75 時，檢測結果判定為陰性；
2.樣本的Ct 值≤30.75 時，檢測結果判定為陽性。
（五）穩(wěn)定性
申請人對該產品實時穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)的研究，確定了在各種條件下本產品的有效保存時間。
其中針對實時穩(wěn)定性研究，采用三批次試劑盒（批號：20131201、20131202、20131203）儲存于-20℃條件下，分別在0、3、6、9、12、15 個月進行準確度、分析特異性、精密度、檢測限以及干擾物質檢驗，12 個月后各項指標符合成品質量要求，確定產品在-20℃條件下，可穩(wěn)定保存12 個月。
開瓶穩(wěn)定性采用三批次試劑盒（批號：20131201、20131202、20131203）開瓶后至于-20℃條件下冷凍保存，在有效期的第六個月和第十二個月后分別對其準確度、分析特異性、精密度、檢測限以及干擾物質進行檢驗，產品各項指標符合成品質量要求，因此開瓶穩(wěn)定性為12 個月。
凍融穩(wěn)定性采用三批次試劑盒（批號：20131201、20131202、20131203）開瓶后至于室溫下解凍，待其完全解凍并放置約15 分鐘左右后，置于-20℃以下冷凍，每凍融2次分別對其準確度、分析特異性、精密度、檢測限以及干擾物質進行檢驗，總共凍融8 次，在凍融6 次后產品各項指標符合成品質量要求，但在反復凍融8 次后部分性能指標不符合成品質量要求，根據(jù)以上實驗結果確定產品的凍融次數(shù)不得超過6 次。
三、臨床評價摘要
申請人在天津市人民醫(yī)院、深圳市人民醫(yī)院、中山大學腫瘤防治中心共3 家臨床試驗機構完成了臨床試驗。采用待考核試劑與診斷該疾病的“金標準”全結腸鏡診斷檢查進行同步比較的方法，驗證本產品的臨床性能。
檢測人群包括：
1.通過地方篩查所有便潛血檢測陽性患者在臨床試驗機構進行腸鏡檢查，同時所有陽性患者留取糞便樣本采用本試劑盒進行檢測。便潛血檢測陽性患者共459 例，其中腸鏡確診的大腸癌陽性病例共計56 例，其余病例為健康人和其他良性疾病患者。
2.門診經臨床醫(yī)生診斷需進行腸鏡檢查的初診患者263例，患者癥狀主要包括排便習慣改變、大便形狀變化、大便帶血、慢性便秘、排便里急后重等癥狀。以上所有患者在進行腸鏡檢查前留取糞便樣本采用本試劑盒進行檢測，腸鏡確診的大腸癌陽性病例共計36 例，其余病例為健康人和其他良性疾病患者。
3.大腸癌術前住院患者248 例，為門診患者主訴上述癥狀或其他檢查懷疑大腸癌且經腸鏡檢查確診為大腸癌，手術前留取患者糞便進行本試劑盒檢測。
4.其余病例：其他消化系統(tǒng)腫瘤患者（治療前）包括食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌、口腔癌，通過病理進行診斷，于治療前采集糞便樣本進行檢測；相關良性疾病患者包括胃炎、腸炎、闌尾炎、結腸炎、消化性潰瘍、大腸息肉、腺瘤；以及大腸癌術后住院患者65 例。
共入組1306 例樣本，其中以上人群中通過腸鏡檢查最終確診為大腸癌的患者共340 例，通過腸鏡確診為大腸癌陰性的患者901 例，大腸癌術后患者65 例。同時進行了179 例樣本的測序檢測，以驗證檢測的準確性，測序結果顯示檢測序列與設計序列一致。
臨床試驗結果：
三家臨床試驗機構共入組340 例大腸癌患者，采用待考核試劑對不同大腸癌分期患者樣本檢測結果見表1。
表1 大腸癌臨床分期樣本檢測結果
三家臨床試驗機構共入組59 例腺瘤患者，采用待考核試劑檢測結果陽性8 例，特異性86.44%；共入組20 例胰腺癌患者，采用待考核試劑檢測結果陽性0 例，特異性100%；
共入組20 例膽管癌患者，采用待考核試劑檢測結果陽性1例，特異性95.00%；共入組20 例肝癌患者，采用待考核試劑檢測結果陽性1 例，特異性95.00%；共入組20 例口腔癌患者，采用待考核試劑檢測結果陽性1 例，特異性95.00%；共入組20 例食管癌患者，采用待考核試劑檢測結果陽性0例，特異性100%；共入組25 例胃癌患者，采用待考核試劑檢測結果陽性2 例，特異性92.00%。
三家臨床試驗機構共入組45 例腸炎患者，采用待考核試劑檢測結果陽性3 例，特異性93.33%；共入組29 例結腸炎患者，采用待考核試劑檢測結果陽性2 例，特異性93.10%；
共入組24 例消化性潰瘍患者，采用待考核試劑檢測結果陽性1 例，特異性95.83%；共入組180 例息肉患者，采用待考核試劑檢測結果陽性14 例，特異性92.22%；共入組20 例闌尾炎患者，采用待考核試劑檢測結果陽性1 例，特異性95.00%；共入組20 例胃炎患者，采用待考核試劑檢測結果陽性1 例，特異性95.00%。
三家臨床試驗機構共入組65 例大腸癌術后患者，采用待考核試劑檢測結果陽性11 例，陽性率16.92%。綜合所有試驗數(shù)據(jù)分析，以全結腸鏡診斷金標準為參照，本產品檢測靈敏度為71.76%，特異性為90.23%。檢測結果與臨床診斷金標準符合率較好，結果見表2
表2
注：65 例術后病例未納入表中作統(tǒng)計分析。
靈敏度： [244/(244+96)]*100%=71.76%
特異性： [813/(813+88)]*100%=90.23%
四、風險分析及說明書提示
參照“YY/T 0316-2016 醫(yī)療器械風險管理對醫(yī)療器械的應用”標準，對該產品進行風險分析。經綜合評價，miR-92a檢測試劑盒（熒光RT-PCR 法）已知和可預見的安全風險主要有以下幾個方面：
1.與生物學危害有關的安全風險，例如原料之間的交叉污染。
2.與環(huán)境有關的危害，例如生產中的廢液沒有分類處理。
3.與使用有關的安全風險，例如使用儀器和試劑時沒有按照說明書要求進行操作。
4.與運輸與儲存有關的安全風險，例如試劑的運輸和儲存超出規(guī)定條件。
5.與預期用途有關的安全風險，例如本產品的檢測結果非唯一診斷依據(jù)，醫(yī)生未結合其他診斷方法進行綜合診斷。
6.功能性失效引起的安全風險，例如未按取樣要求取樣。
7.與生產有關的安全風險，例如使用未經過驗證的原材料。通過環(huán)境控制、生產監(jiān)控、原材料管理、成品檢驗和增加說明書警示內容等防范措施，對該產品的已知和可預見的安全風險進行控制和降低，剩余風險可以被控制在驗收準則規(guī)定的可接受范圍內，同時沒有帶來新的危害與安全風險。在目前認知水平上，認為該產品上市帶來的獲益/受益大于風險。
盡管目前認為該產品的受益大于風險，但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的防控，已在產品說明書中提示以下信息：
1. 該產品用于體外定性檢測人糞便樣本中的miR-92a核酸。
該產品用于便潛血陽性、綜合其他癥狀如排便習慣改變、大便形狀變化、慢性便秘、排便里急后重等經臨床醫(yī)生診斷建議腸鏡檢查同時由于不同原因拒絕進行腸鏡檢查的患者，用于臨床對大腸癌的輔助診斷，檢測結果陽性不作為大腸癌早期診斷或確診的證據(jù)，檢測結果陰性也不能排除大腸癌的可能，患者最終診斷應依據(jù)腸鏡檢查結果。該產品不用于普通人群的腫瘤篩查。
2. 警示及注意事項：產品說明書中介紹了該產品檢驗方法的局限性及使用中的注意事項。
綜合評價意見
本申報項目為境內第三類醫(yī)療器械產品注冊，屬于創(chuàng)新審批項目（編號：201600047）。申請人的注冊申報資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》（國務院令第680 號）、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令2014 年第5 號）等相關醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經系統(tǒng)評價后，建議準予注冊。
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